【摘要】 细胞增殖及毒性检测是生物相容性测试的一种，检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况，即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响，来评价药物或材料的毒性或者活性，主要用于药物活性筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、抗肿瘤药效测定等；常用MTT法或者CCK-8法检测，另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像，更直观的记录细胞的存活情况。

小伙伴们是不是经常碰到需要检测细胞增殖情况，比如想知道材料或者合成的药物与细胞处理后，怎么知道细胞存活量？敲除某个与细胞生长有关的基因以后，细胞是挂了还是增加了？ 今天实验菌给您扒一扒如何目前常用的细胞增殖检测方法。

 

背景介绍

 

细胞增殖检测实验的意义： 

 

细胞增殖是细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般用于分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

 

本文亮点 常见的细胞增殖检测包含这些： 

1.直接计数法 

2.MTT检测法 

3.MTS检测法

4.CCK-8检测法 

5.3H-TdR渗入法

6.Brdu/EdU检测法

7.CFSE检测法

8.刃天青还原法

9.活细胞蛋白酶底物法/ATP法

 

这么多检测方法，小主们是不是挑花眼啦，别急，别急，咱来详细了解一下

 

直接计数法

 

直接利用计数板或计数仪得出细胞数目，对数目进行分析比较。是检测细胞增殖的方法之一，简单易操作，也非常公认，只是耗费时间长，所需细胞量多，当然最重要的是 费眼睛啦。

 

MTT法

 

在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色甲臢化合物，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度（OD490或者570)，从而定量测定细胞的存活比例，细胞增殖越多越快，对应的吸光度越高；细胞毒性越大，对应的吸光度越低。

 

MTS法 

 

在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能MTS还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，而死细胞无此功能。这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理，操作比MTT法更为简洁方便。且测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。

 

CCK-8法 

 

CCK-8细胞活性检测试剂中含有WST-8 —— 一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以为线粒体内的脱氢酶验明正身。在脱氢酶作用下，WST-8被还原生成橙黄色的甲瓒产物，用酶联免疫检测仪在OD 450nm波长处测定其光吸收值。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

 

3H-TdR渗入法 

 

胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，那之后的每一条新合成的DNA双链像被安装了GPS定位器一样，都能被液体闪烁计数器检测到，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

 

BrdU/EdU检测法 

 

Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶的衍生物，能代替胸腺嘧啶合成DNA，这种掺入是稳定存在的，随着DNA的复制进入子细胞中。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体在组织切片或细胞爬片上显示，能通过免疫荧光、流式细胞仪检测合成DNA的量，判断细胞的增殖能力。 BrdU抗体比较大，由于DNA双链结构的位阻，BrdU抗体无法直接与双链上的BrdU结合，需要对DNA进行变性(方法包括酸解，热解，酶解等)，变性后DNA单链上的BrdU才能与BrdU抗体结合，因此做BrdU细胞增殖实验一定要变性，且变性程度也很重要。

 

EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，是另一个能代替胸腺嘧啶（T）合成DNA的物质。 EdU能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过EdU与Apollo荧光染料的特异性反应能快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、DNA修复、细胞标记示踪等方面的研究。 EdU是BrdU的升级，EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可快速有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

 

CFSE检测法 

 

羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有能与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使得CE成为一种良好的细胞标记物。 CFSE进入细胞后与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可检测一个增殖细胞群中，各连续代细胞的荧光强度并对其进行分析。

 

刃天青还原法 

 

刃天青是氧化还原反应的指示剂，活细胞能够将刃天青转化为一种荧光产物——试卤灵，而不具有活力的细胞会很快丧失新陈代谢能力，则不能产生荧光信号。在560nm激发，590nm读取荧光信号，荧光信号与细胞活力成正比。一般作为检查牛乳中微生物质量的指示剂。

 

活细胞蛋白酶底物法/ATP法 

 

活细胞蛋白酶是细胞活力的标志物，只存在于活细胞内，一旦细胞膜发生破损，酶活力立即消失。，现有各类试剂盒（如CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay类试剂盒），大致的原理都是利用荧光基团标记的细胞蛋白酶的底物，可以穿透细胞膜进入细胞内。底物上的荧光基团可以被细胞内的酶切割释放出来，受到激发，产生与活细胞数量成正比的荧光。

 

ATP 是活细胞新陈代谢的重要指标，CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay试剂盒是利用ATP能参与试剂盒提供的底物和荧光素酶反应的原理，在ATP的参与下产生发光信号，信号强度和ATP呈正相关。可用于定量检测细胞或者线粒体ATP的含量。

 

看了上面还不知道做那种，别着急，带着文献和样品，找生物实验菌，咱一步步来沟通确认。 

 

本文所有内容文字、图片和音视频资料，版权均属科学指南针网站所有，任何媒体、网站或个人未经本网协议授权不得以链接、转贴、截图等任何方式转载。