【摘要】 为了执行co-IP，第一步是准备细胞裂解物，内源性或外源性表达感兴趣的蛋白质。

蛋白-蛋白相互作用调节多种细胞过程，包括信号转导、蛋白定位和酶激活。共免疫沉淀法(Co-IP)已经应用了几十年，由于其重复性高、操作简单且相对便宜，因此仍然是分析蛋白质-蛋白质相互作用最有效的方法之一。

 

为了执行co-IP，第一步是准备细胞裂解物，内源性或外源性表达感兴趣的蛋白质。选择一种最佳的裂解缓冲液，它足以提取感兴趣的蛋白质，但不破坏其复杂的形成，是试验成功的关键因素之一。一般来说，包括NP-40和Triton X-100在内的非离子洗涤剂会破坏脂质-蛋白质相互作用，但不会破坏蛋白质-蛋白质复合物的形成，而离子洗涤剂如Chaps会破坏两者。

 

虽然有各种方法可用于分析蛋白质-蛋白质相互作用，但共免疫沉淀(co-IP)仍然是发现新的蛋白质相互作用或确定蛋白质物理关联的最经典和常用的方法之一。该试验首先在适当的裂解缓冲液中制备总细胞或组织裂解液。裂解物中感兴趣的蛋白质使用特定抗体捕获，并使用树脂与其结合蛋白一起沉淀。

 

经过一系列洗涤去除裂解物中的非结合蛋白后，所得免疫复合物进行免疫印迹、凝胶内蛋白染色或质谱分析，以确定感兴趣的蛋白-蛋白相互作用。通过将裂解物与特异性靶向感兴趣蛋白质的抗体孵育，捕获感兴趣的蛋白质及其物理相互作用伙伴。选择特定抗体是IP/co-IP的另一个关键因素。

 

igg结合蛋白A/G共轭树脂(如琼脂糖、蔗糖或磁珠);然后与裂解物-抗体混合物孵育，通过离心、柱或磁架/支架沉淀抗体-蛋白质复合物。为了消除非结合蛋白，树脂-抗体-蛋白复合物被多次清洗。

 

最后，通过在变性缓冲液(如Laemmli缓冲液)中煮沸，抗体-蛋白复合物从树脂中释放出来，并准备进行分析[1]。

 

[1] Tang, Z., Takahashi, Y. (2018). Analysis of Protein–Protein Interaction by Co-IP in Human Cells. In: Oñate-Sánchez, L. (eds) Two-Hybrid Systems. Methods in Molecular Biology, vol 1794.

 

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