【摘要】 一般来说,包括NP-40和Triton X-100在内的非离子洗涤剂会破坏脂质-蛋白质相互作用,但不会破坏蛋白质-蛋白质复合物的形成,而离子洗涤剂如Chaps会破坏两者。
蛋白-蛋白相互作用调节多种细胞过程,包括信号转导、蛋白定位和酶激活[1]。
共免疫沉淀法(Co-IP)已经应用了几十年,由于其重复性高、操作简单且相对便宜,因此仍然是分析蛋白质-蛋白质相互作用最有效的方法之一。
为了执行co-IP,第一步是准备细胞裂解物,内源性或外源性表达感兴趣的蛋白质。
选择一种最佳的裂解缓冲液,它足以提取感兴趣的蛋白质,但不破坏其复杂的形成,是试验成功的关键因素之一。
一般来说,包括NP-40和Triton X-100在内的非离子洗涤剂会破坏脂质-蛋白质相互作用,但不会破坏蛋白质-蛋白质复合物的形成,而离子洗涤剂如Chaps会破坏两者。
通过将裂解液与特异性靶向感兴趣蛋白质的抗体孵育,捕获感兴趣的蛋白质及其物理相互作用。
选择特定抗体是IP/co-IP的另一个关键因素。
igg结合蛋白A/G共轭树脂(如琼脂糖、蔗糖或磁珠),然后与裂解物-抗体混合物孵育,抗体-蛋白质复合物通过离心、柱或磁架/支架沉淀。
为了消除非结合蛋白,树脂-抗体-蛋白复合物被多次清洗。
最后,通过在变性缓冲液中煮沸,抗体-蛋白复合物从树脂中释放出来,并准备进行分析。
通过co-IP检测弱和/或瞬时蛋白质相互作用可能具有挑战性;然而,如果结合交联或其他蛋白质-蛋白质相互作用方法,则可以克服这一问题。
[1] Tang Z , Takahashi Y .Analysis of Protein–Protein Interaction by Co-IP in Human Cells[J].methods in molecular biology, 2018.DOI:10.1007/978-1-4939-7871-7_20.
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