植物自噬的透射电镜TEM研究

自噬是真核生物高度保守的大分子降解途径^[1]。在植物中，自噬是由几种胁迫条件诱导的，包括饥饿、氧化胁迫、盐胁迫和衰老^[2]。在自噬过程中，称为自噬体的双膜囊泡在细胞质中形成并运输到中央液泡，在那里自噬体的外膜与液泡膜融合。然后称为自噬体的单膜结构进入液泡腔并最终被降解。

迄今为止，已经建立了许多检测植物自噬的方法。常用的检测方法有共聚焦显微镜、电子显微镜和生化法。共聚焦显微镜检测采用与荧光蛋白融合的自噬标志物ATG8、ATG5、SH3P2标记自噬相关结构。^{[3, 4]}此外，荧光嗜酸染料如单胺尸胺（MDC）也被用于标记植物细胞中的自噬结构。测定自噬通量的生化方法是检测ATG8与ATG8- pe的比值，或GFPATG8与GFP的比值。然而，TEM因其高分辨率而在这些方法中显着突出，从而提供了更清晰的自噬结构及其货物信息。因此，通过透射电镜观察，可以对自噬进行定性和定量分析。在透射电镜下，自噬体清晰可见为两个由电子半透明孔隔开的膜双层。同时，它含有降解的货物。一般来说，在非选择性自噬过程中，自噬结构的大小为0.5 ~ 1.5 μm。

图1 SH3P2-GFP响应自噬诱导。^[3]

图2 ATG5-GFP亚细胞模式自噬诱导。^[4]

对于选择性自噬，自噬结构的大小取决于特定的底物。Zheng等人^[5]描述了用透射电镜检测GAPC沉默植物细胞自噬活性的方案。在25°C的生长室内，在16小时的光照/8小时的黑暗周期下，烟叶植物生长4周。将含有pTRV1和pTRV2的农杆菌菌株GV3010或其衍生物GAPCs或GAPCs/ATG3共沉默构建物按1:1的比例混合，渗透到植物的顶部两片叶片中，分别沉默植物中的GAPCs和GAPCs/ATG3。当目标基因在浸润后16-18天（dpi）沉默成功时，将20 μΜ E-64d渗透到基因沉默成功的两片新叶中。E-64d处理8-12小时后，将处理过的叶片切成小片（1mm × 1mm）。将小片叶片用300 μl多聚甲醛-戊二醛固定液（2%/2.5%，pH 7.2）固定于1.5 ml管中。使用隔膜真空泵在0.1 MPa下抽真空10-30分钟，直到碎片沉入管的底部。用牙签戳这些碎片，帮助它们沉到管子的底部。用多聚甲醛-戊二醛固定液（2% /2.5%，pH 7.2）在冰上固定1小时。

图3 对照和VIGS植物自噬样结构的透射电镜检测。

用0.1 M PBS缓冲液在摇床中洗涤3次，每次15分钟（应在摇床中完成）。用oso4 -六氰亚铁酸盐固定液（1%/1.5%）在冰上固定1h。用0.1 M PBS缓冲液室温（RT）洗涤3次，每次15分钟。用ddH2O在室温下洗涤3次，每次10分钟。在室温下，用1%醋酸铀酰在暗处染色1小时。用ddH2O在室温下洗涤3次，每次15分钟。在30%、50%、70%、80%、90%和95% （v/v）的乙醇梯度系列中脱水，每次10分钟。用100%乙醇脱水3次，每次10分钟。100%环氧丙烷脱水2次，每次10分钟。在室温下，将样品与环氧丙烷:epon 812按2:1的体积比例在摇床中孵育30分钟。在室温下，将样品与环氧丙烷:epon 812按2:1的体积比例在摇床中孵育30分钟。用epon 812在摇床中孵育样品过夜。epon 812刷新3次，每次3小时。用epon 812将样品埋入40孔平板埋入模中。用epon 812在37℃下渗透样品4小时。树脂在60°C下，24-48小时。用美工刀将嵌块切割至能锯出样品为止。继续用玻璃刀切割样品，直至表面光滑。用美工刀将样品表面切成梯形。用金刚石刀在超微切片机上将嵌入块切成70纳米的超薄切片。用睫毛笔在涂有formvar涂层的网格上收集它们。用染色机用2%醋酸铀酰染色30分钟，0.2%醋酸铅染色5分钟。在电子显微镜下检查切片。观察叶肉细胞的自噬结构，记录自噬结构数目和细胞数目。

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