【摘要】 为了优化通过透射电子显微镜（TEM）进行化学固定成像时这些细胞超微结构细节的可视化，Benjamin K. August等人[2]提出了两个问题:固定时使用的羧酸盐或磷酸盐缓冲液是否存在可检测到的差异，以及固定后用亚铁氰化钾还原的四氧化锇或四氧化锇是否会影响膜保存方面的对比度。

威斯康星大学麦迪逊分校的科学家们经常将人类多能干细胞（hPSCs）分化成星形胶质细胞，以研究它们的生理学。这些细胞通常被植入24孔聚苯乙烯培养板的玻璃罩上[1]。为了优化通过透射电子显微镜（TEM）进行化学固定成像时这些细胞超微结构细节的可视化，Benjamin K. August等人[2]提出了两个问题:固定时使用的羧酸盐或磷酸盐缓冲液是否存在可检测到的差异，以及固定后用亚铁氰化钾还原的四氧化锇或四氧化锇是否会影响膜保存方面的对比度。在玻璃罩上培养的星形胶质细胞的可靠、一致的固定和标本制备对于产生可重复性和及时的实验结果至关重要。传统的方法通常涉及将液体试剂从笨重的容器中移动到繁琐的容器中，以执行大量的手动液体试剂交换。过度的搬运会损坏玻璃盖。

 

改进的样品制备方案是普遍需要的，但是时间和资源的限制往往迫使TEM实验室技术人员使用继承的方法，而不是进行潜在性能更好的试剂的头对头比较。现在，使用机器人处理可以简单方便地制备多个相同的标本来测试各种固定和染色方案，而使用传统的手工技术很难比较这些变量。

 

一个实验室机器人被用来比较在玻璃罩上培养细胞的不同条件，在同一个聚苯乙烯板上培养细胞。初始固定后，将24孔聚苯乙烯板放置在机器人的甲板上。其余步骤（见下表1）使用精确的机器人移液完全自动化，直到树脂包埋。全自动机器人移液确保所有试剂被输送到各自的样品孔中，从而确保了高可靠性和可重复性的结果。

 

表1 机器人步骤。

 

机器人在各自的缓冲液中冲洗后，机器人送出等量的四氧化锇进行后固定;两个缓冲组各2个样品分别用1%亚铁氰化钾还原的缓冲液（根据初始固定计划选择PB或羧酸盐）中1%的四氧化锇处理，每个缓冲组各2个样品用未还原亚铁氰化钾的1%四氧化锇处理（见表2）。所有样本组均术后固定30分钟。

 

表2 试剂在加工板上的位置。

 

当与两种实验锇条件相结合时，在羧酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液之间没有检测到总体图像质量的差异。与未还原的锇相比，用亚铁氰化钾还原锇固定后的样品中，观察到明显的差异，特别是在膜保存、总体对比和识别细胞骨架元素（即微管和神经丝）的能力方面。磷酸盐缓冲液与钙酸盐缓冲液的使用似乎对图像质量、膜保存、对比度或超微结构细节没有任何显着影响。

 

实验室机器人使能够轻松地在一个简单的实验中测试4个变量，使用计算机控制的精确自动化液体处理，零人为错误的可能性，因为试图手动将复杂的试剂阵列正确地分配到每个单独的样品。这种革命性的性能提升是由于可编程实验室机器人的好处，它的决策错误的可能性。

 

[1]. https://www.waisman.wisc.edu/stem-cell-research-rogram/zhang-lab/.

[2]. August, B. K.;  Kong, L.;  Massey, R. J.;  Zhang, S.-C.; Strader, T. E., Robotic Optimization of Specimen Preparation Protocol for Astrocytes Seeded on Coverslips for Imaging by Transmission Electron Microscopy （TEM）. Microsc. Microanal. 2023, 29 （Supplement_1）, 1106-1110.

 

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