【摘要】 与显微镜相比，通过流式细胞术分析细胞的主要优点是分析速度

流式细胞术是一种基于激光或阻抗的自动化高通量方法，可以非常快速地分析细胞群内单个细胞的多种化学和物理特征。这是一项极其强大的技术，已在丝状真菌中使用了四十多年。尽管通常使用该技术逐个细胞地快速分析细胞群内的单个细胞，但流式细胞术也可用于分析细胞（例如孢子）聚集体或整个微菌落。

 

活细胞或固定细胞可以用多种荧光报告基因进行染色，以标记不同的细胞成分或测量不同的生理过程。流式细胞术还适用于通过分析非标记细胞的光散射特性来测量细胞大小、相互作用、聚集或形状。荧光激活细胞分选 (FACS) 是流式细胞术的一种特殊形式，它提供了一种根据每个细胞的荧光和/或光散射特性将异质细胞混合物分选到两个或多个容器中的方法。

 

与显微镜相比，通过流式细胞术分析细胞的主要优点是分析速度：每秒可以分析数千个细胞或在几分钟内分选。流式细胞术的缺点是无法及时跟踪特定细胞，并且通常缺乏与单个细胞相关的空间信息。

 

与显微镜相比的一大优势是，使用 FACS 时，可以对具有所需特征的细胞进行分类以进行下游实验（例如生长、感染、酶生产、基因表达测定或“组学”方法）解释了流式细胞术和 FACS 的基本概念，定义了其与显微镜相比的优点和缺点，并描述了这些强大的技术在丝状真菌中的广泛应用。

 

图1通过门控分离标记细胞的亚群。烟曲霉野生型菌株 (CEA10) 的休眠分生孢子用卡尔科弗洛白(CFW) 和伴刀豆球蛋白 A (ConA) 标记。每个染色的两个亚群被门控，总共 4 个特定亚群。CFW（用 355 nm 激光激发）和 ConA（用 488 nm 激光激发）的荧光强度分别绘制在 Ye 轴和 X 轴上。列出了每个门中的细胞数量（占总数的%）【1】

 

图1显示了一个典型的多重标记实验，其中烟曲霉CEA10野生型菌株的休眠分生孢子同时用Calcoflor White（CFW）和Concanavalin A（ConA）标记。 CFW 与几丁质结合，ConA 与细胞壁中的（葡糖）甘露聚糖结合。

 

使用统计分析（Vinck 等人，2005），测试总群体中的正态分布混合，我们拟合每个标记分生孢子群体的两个亚群体（CFWe 和 ConA 染色），并门控总共 4 个亚群体。 CFWe 和 ConA 的不同组合染色：CFW 和 ConA 水平较低的亚群（占人群的 24.6%）；一种具有低 CFW 和高 ConA (3.5%)；一种具有高 CFW 和低 ConA (0.6%)；一种具有高 CFW 和高 ConA (5.1%) 荧光强度水平。

 

剩余的百分比 (66.2%) 由未标记的细胞、具有聚集细胞的事件或不适合子群的任何置信区间的单个细胞组成，因为由于 1000 次迭代的引导，它们非常狭窄。

 

理论上，使用这种方法可以用许多不同的荧光标记标记来标记细胞，以检测稀有的亚群。使用 FACS 可以对这些亚群进行分选，并且细胞可用于下游实验，例如涉及转录组学、蛋白质组学、应激挑战、免疫反应或宿主细胞相互作用。

 

【1】Bleichrodt R J, Read N D. Flow cytometry and FACS applied to filamentous fungi[J]. Fungal biology reviews, 2019, 33(1): 1-15.