【摘要】 逆稳定同位素标记（InverSIL）通过使用天然同位素丰度的化合物作为前体来标记完全同位素取代的培养物，从而消除了这一缺点

稳定同位素标记在初级和专业代谢研究中都是一种有价值的技术。利用这种方法，研究人员可以追踪生物系统中同位素取代的前体代谢物的转化和结合，从而提供分解代谢和生物合成途径的机制细节。稳定同位素标记的一个缺点是同位素取代前体的可用性，这些前体可能非常昂贵或无法获得。

 

逆稳定同位素标记（InverSIL）通过使用天然同位素丰度的化合物作为前体来标记完全同位素取代的培养物，从而消除了这一缺点。例如，研究人员可以在含有（13C）葡萄糖作为唯一碳源的培养基上培养生物体，以创建完全取代13C的培养物，随后以其自然丰富的形式（即主要是12C）喂养任何前体，并通过质谱法跟踪其代谢。

 

该技术已用于与生物合成、结构解析、6和发现有关的天然产物研究。Tashi C. E等人[1]报告了一个完整的工作流程，用于识别非靶向代谢组学数据中的逆标记，不需要用户指定这种质量变化。

 

该方法依赖于使用MZmine 3平台的质谱特征发现和使用Metabolite Atlas Python包的标记条件之间更可靠的比较证明这种工作流程可以识别包含多个前体以及同一前体的不同部分的代谢物。

 

使用这种方法还发现了甲基营养体中部分C1穿梭辅酶的可能生物合成来源，甲基营养体是在没有碳-碳键的还原碳底物（如甲醇和甲烷气体）上生长的生态重要细菌。设想这个工作流程将使InverSIL在初级和专门代谢研究中更加常规地使用。

 

 

图1 利用L-蛋氨酸InverSIL鉴定甲基杆菌Leaf119产生的酰基- HSL群体感应信号。

 

 

图2 利用L-蛋氨酸和PABA InverSIL鉴定Methylobacterium sp.菌株Leaf119产生的C1转移辅酶dH4MPT甲基化。

 

 

图3 重叠质谱显示L-（甲基2H3）蛋氨酸的两个甲基2H3单元并入(A)甲基- dH4MPT和(B)含蝶呤的甲基- dH4MPT片段。

 

当使用工作流程评估得到的非目标数据时，确定了12C甲醇数据集中的886个独特特征，（13C）甲醇数据集中的814个独特特征，以及278个高可信度12C/13C特征对。

 

使用这些特征对，在（13C）甲醇加l12甲硫氨酸的条件下，工作流正确地识别了两个酰基-HSL信号的特征，这些信号包含来自L-蛋氨酸的四个碳，而不需要指定这些信息（图1）。

 

工作流程还检测到一个特征，该特征包含一个或（在仔细检查原始数据后）两个来自蛋氨酸的单碳单元，这可能是两个甲基化的结果（图2A和2B）。

 

这证明了该工作流程在以公正的方式识别包含感兴趣的前体部分的代谢物方面的实用性。然而，据所知，甲基营养细菌产生的dH4MPT甲基化的起源尚未确定。非靶向反标记数据支持这些甲基化可能来自l -蛋氨酸的结论（图2A和2B）。

 

为了提供进一步的证据，将Leaf119培养在含有L-（甲基2 H3）蛋氨酸的12C -甲醇上，并检测到两个甲基2 H3单元融入到甲基-dH4MPT的含蝶呤片段中（图3）。这与甲基营养细菌Leaf119产生的dH4MPT的C7和C-9蝶呤甲基化是一致的，这些甲基化来源于L-蛋氨酸的甲基（图2D）。

 

因为四氢生物蝶呤骨架的其余部分是由鸟苷三磷酸生物合成的，而鸟苷三磷酸不含由蛋氨酸甲基衍生的碳。这区分了甲基营养细菌中的dH4MPT生物合成途径与产甲烷古菌中的某些途径。

 

由于前体的可用性，在许多情况下，InverSIL比传统方法更容易获得用于初级和专门代谢研究的稳定同位素标记实验。该研究报告了一种工作流程，用于识别非靶向质谱数据中的反标记，而无需事先了解所标记的代谢物或前体原子的数量。

 

通过对l -蛋氨酸和PABA前体的InverSIL工作流程，确定了蝶呤甲基化在dH4MPT中可能的生物合成来源，dH4MPTT是甲基化营养细菌使用的一种重要的C1转移辅酶。设想这一工作流程将使未来发现天然产物和其他代谢产物，其中包含感兴趣的前体。

 

[1] T.C.E. Liebergesell, E.G. Murdock, A.W. Puri, Detection of Inverse Stable Isotopic Labeling in Untargeted Metabolomic Data, Anal. Chem. 96 (2024) 16330-16337.

 

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