【摘要】 AuNPs内的197Au同位素被王水完全消化，并通过电感耦合等离子体质谱（ICPMS）灵敏地检测，以产生准确的目标DNA定量结果。

临床诊断、预后和治疗的主要任务是分析与疾病相关的突变基因。由于体液中某些特定基因的丰度极低且浓度变化，信号放大策略的发展受到了极大的关注。作为一种无酶扩增策略，杂交链反应（HCR）因其无酶性、等温温和的条件、简单的方法和优良的扩增效率而引起了广泛的研究兴趣。

 

在HCR过程中，单链DNA通过链式反应被扩增成长双链DNA，在此过程中，一对互补DNA序列之间的识别和杂交事件接连发生。HCR已被用于开发灵敏的生物传感器，主要是荧光生物传感器，用于检测各种分析物，包括小分子，核酸，蛋白质和细胞。

 

尽管它们取得了巨大的成功，但对于体液中不同突变基因的浓度变化很大，已建立的策略往往受到有限的线性定量范围的挑战。

 

Liu等人[1]首次报道了利用金属纳米粒子标记和随后的元素质谱检测进行HCR扩增DNA定量分析，充分利用了金属纳米粒子标记的高灵敏度和宽线性范围潜力，以及HCR扩增的无酶特性。

 

选择人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）相关DNA作为模型靶分析物在目标DNA存在的情况下，由生物素化辅剂1 （Aux 1）和辅剂2 （Aux 2）交替诱导级联链反应，然后通过链亲和素和生物素的有效相互作用将纳米金标记的链亲和素（AuNPs-SA）与生物素化辅剂连接。

 

AuNPs内的197Au同位素被王水完全消化，并通过电感耦合等离子体质谱（ICPMS）灵敏地检测，以产生准确的目标DNA定量结果。该方法具有较低的氨苄检测限和5个数量级的线性范围，在临床诊断中具有广阔的应用前景。

 

设计了一种针对目标DNA的无酶扩增试验，结合了杂交链反应扩增，AuNP标记和元素质谱检测。分析原理如图1所示。

 

首先，将胺功能化的DNA捕获探针与羧基修饰的磁珠偶联，并用EDC激活磁珠。在靶DNA （tDNA）存在的情况下，捕获探针会与tDNA的末端杂交形成双工结构，然后将tDNA的另一端与生物素化的扩增DNA探针（Aux1）杂交形成三明治结构。当加入Aux2时，由Aux1和Aux2交替杂交引发连锁反应。

 

最后，通过生物素和链亲和素的相互作用将AuNPs-SA与DNA结合。加热释放核苷酸链，磁铁分离MBs后，将上清中的AuNPs溶解于王水中，用ICPMS记录197Au的信号（图1a）。

 

通过TEM和紫外-可见分光光度法（UV）对AuNPs-SA进行了表征。AuNPs-SA的直径约为15 nm。与未修饰的AuNPs相比，与链霉亲和素结合后的AuNPs在532 nm处有很强的吸收峰，红移约12 nm。通过比较无Aux、一次杂交周期和多次杂交周期放大的信号，证明了该方法的可行性（图1b）。

 

 

图1 (a) HCR扩增和AuNP标记示意图。(b)可行性研究的实验结果。

 

 

图2 优化Aux DNA的浓度(a)、HCR的反应时间(b)、SA-AuNPs的稀释率(c)和sa -生物素的反应时间(d)。

 

HCR扩增的效率取决于Aux1和Aux2的含量，因为dsDNA链的长度与Aux DNA的浓度和HCR的反应时间直接相关。如图2a所示，随着Aux DNA浓度的增加，信号从0到1mm迅速增加，然后信号强度在1到2mm范围内趋于稳定；因此，后续实验选用1 mM的Aux DNA浓度。

 

如图2b所示，信号强度随着HCR反应时间的增加而增加，选择120 min作为HCR的最佳反应时间。如图2c所示，随着稀释率从1:5增加到1:0, 197Au信号迅速增加。然而，由于磁珠与AuNPs之间的非特异性吸附，当稀释率低于1:1时，背景信号略有增加。

 

因此，选择AuNPs-SA的最佳稀释率为1:1。如图2d所示，信号在初始阶段急剧改善，在40min后趋于平衡；因此，后续实验选择sa -生物素的反应时间为40 min。

 

综上所述，杂交链反应、金属纳米颗粒标记和随后的元素质谱检测，开发了一种无酶、宽线性范围、简单灵敏的DNA检测方法。杂交链式反应策略可以快速延长dsDNA链，捕获大量的AuNPs，从而获得与靶DNA的巨大比例的197Au。

 

在人血清样品中的检出限为0.56 amol，线性范围为5个数量级，加样回收率为89 ~ 108%，表明其在临床样品中的应用潜力。由于microRNA (miRNA)和蛋白质生物标志物对癌症的发展，细胞凋亡和分化很重要，因此通过整合基于核酸的信号放大和靶标识别策略，进一步发展所提出的检测方法可能直接针对miRNA和蛋白质分析。

 

考虑到目前有大量的金属纳米颗粒候选标签可供选择，无酶扩增多重检测的开发正在进行中。

 

[1] Y. Liu, Y. Ding, Y. Gao, R. Liu, X. Hu, Y. Lv, Enzyme-free amplified DNA assay: five orders of linearity provided by metal stable isotope detection, Chem Commun (Camb) 54 (2018) 13782-13785.

 

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