【摘要】 激光扫描共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的具有划时代意义的高科技产品。

激光扫描共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的具有划时代意义的高科技产品。随着计算机和激光的发明，许多科学家将这两种技术结合起来，提高了激光共聚焦显微镜的成像效果。1987年，《自然》杂志发表文章“共聚焦显微镜时代的到来”，预示着它将成为科学研究的有力工具之一。它在材料科学、生物科学、医学等领域发挥了巨大的作用。其中，超高分辨率荧光显微镜技术，如STED、STORM等，与共聚焦显微镜相结合的商业化产品应运而生。结合其技术特点，人类可以突破可见光衍射极限的限制，通过可见光观察纳米尺度的微观世界，开发这项技术的三位科学家也因其杰出贡献获得2014年诺贝尔化学奖。

 

激光扫描共焦显微镜是测量表面形貌的有力工具。可用于精密测量领域的台阶高度测量、非球面形状测量和精细结构测量。激光扫描共聚焦显微镜系统主要由扫描控制系统、微光学系统、计算机系统和图像输出设备四部分组成。激光扫描共聚焦显微镜的主要部件是显微镜，它直接关系到系统的图像质量。显微镜的光路是一个没有离心机的光学系统，光学选项可以插入而不影响成像质量和测量精度。扫描控制系统由Z轴、X-Y焦平面、共焦针孔和光电倍增管四部分组成。

 

激光扫描共聚焦显微镜具有高分辨率观察，可实现深聚焦，光斑半径最小为2㎛ 能清晰观察样品表面；同时，它具有很高的通用性，可以测量各种目标，具有很高的角度特性和水平分辨率；具有自动调节激光接收的“AAGII功能”，可实现两次扫描精确测量的“双扫描功能”。当单次扫描无法测量时，系统会自动改变光接收元件的灵敏度进行两次扫描，然后根据目标优化光接收，可以精确测量形状复杂的小物体或不同材质的物体。

 

激光扫描共聚焦显微镜采用激光束作为光源。激光束通过照明针孔，被分光镜反射，聚焦在样品上，扫描样品焦平面的每个点。之后，反射样品形状的光信号通过入射光路直接返回分光镜，检测到针孔时会聚一次，由光电倍增管采集后送入计算机。发送后，图像显示在显示屏上，也就是说，焦平面像剑一样切割样品的三维表面，得到不同的二维横截面图像，并将这些二维横截面图像合并得到原始形状。在这个过程中，只有焦平面上的光才能通过探孔，而来自焦平面外区域的光在探孔平面上远离焦点，不能通过小孔。因此，非观察点的背景被涂成黑色，对比度增加，图像反射清晰。由于照明针孔和探针针孔与物镜的焦平面共轭，所以焦平面上的点同时聚焦在照明针孔和探针针孔上，焦平面以外的点与探针针孔相连，即共聚焦。

 

相对于普通款式也光学显微镜，“共聚焦”通过聚焦的激光对样品进行扫描，这种方法可以排除焦点意外的部分反射光干扰，使侧向和轴向的分辨率提高。激光共聚焦显微镜的测量方法可以达到0.001μm甚至更精细的分辨率水平，普通宽视野光学显微镜最大理论分辨率为0.2μm，透射电子显微镜分辨率可以到达0.1nm，LSCM介于这两种常用的形态学技术之间，应用于光学量测中的触控屏领域具有很多独特的优势。LSCM快速无损测量，更适合监控的需要，目前唯一的不足是还需要人工选点，不能进行测量程序的二次开发实现大面积、多点自动测量，人工选点就存在一定的局限性和统计偏差。

 

激光共聚焦显微镜由于采用共聚焦与光学扫描系统结合的方式，即便是尖锐的轮廓或者无法触及的高纵横比零件也能全面进行分析。在测量表面粗糙度上，即便样品为弧形表面，也能完成直线及表面粗糙度的测量。在测量膜层厚度方面，其膜厚功能可以通过非破坏性方式来捕捉和分析膜层信息。使用激光扫描共聚焦显微镜时会涉及以下几个信息：①物镜倍率：它会影响到观察到的图像分辨率，物镜倍数越大所观察到的图像分辨率越高。②扫描模式：应根据样品的相貌状态和所需的量测参数来设置的，当非透明样品需要观察表面轮廓时一般采用的是表面轮廓扫描模式，而透明样品时将选择透明物上表面扫描模式。③ND滤镜：它改变的是样品反射回来光束能量的滤过情况，ND滤镜改变也会影响扫描的时间。④精准度：它改变的是激光共聚焦显微镜的量测精度模式，超精细设定会比标准设定更加符合样品的表面形貌特征，但是超精细的扫描的时间会比标准的长。⑤Z轴节距：它是改变在激光共聚扫描的时候每一个层面的相隔距离。

 

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