【摘要】 石蜡包埋的组织随后被切片成3微米厚的切片，在二甲苯中脱烃，如前面所述，在乙醇梯度中再水化，用含水安装介质并用盖子密封。

非线性显微镜，即多光子成像和二次谐波生成（SHG），是一种公认的非侵入性技术，可用于细胞外基质（ECM）的成像。通常，在体内对新鲜切除的组织或活检进行测量。

 

在Michael G. Monaghan等人[1]的文章中描述了再水合石蜡包埋切片对多光子和SHG发射信号的影响，以及在去染色方案前后从苏木精和伊红（H&E）染色切片中获取非线性图像。其研究的目的是通过应用清除协议来减少石蜡对石蜡切片发射谱的影响，从而实现石蜡包埋组织切片的充分多光子成像。

 

作为成像的模型组织，从当地屠宰场获得的猪心脏中切除肺半月瓣，在PBS中冲洗两次，并在进一步处理之前切成三个小叶。这些新鲜的传单被放置在盖子上进行多光子成像。成像后，将组织在4℃下用4% PFA固定过夜，随后包埋石蜡。

 

石蜡包埋的组织随后被切片成3微米厚的切片，在二甲苯中脱烃，如前面所述，在乙醇梯度中再水化，用含水安装介质并用盖子密封。作为对照，未经处理的石蜡切片(未脱蜡和未复水化)也用Dako Faramount涂覆。所有样品在成像前在室温下放置过夜。

 

在心脏瓣膜小叶的脑室、海绵层和纤维层进行影像学检查。对脱烃组织进行常规H&E染色，然后通过增加酒精梯度脱水，并使用Isomount 2000将切片用盖盖固定。在多光子成像前，将载玻片留置过夜。

 

观察仪拍摄h&e染色切片的亮场图像。其研究实现了在石蜡包埋切片上同时进行多光子诱导的自发荧光和SHG成像。

 

研究结果表明，将组织切片置于生理状态会显著改善非线性信号，尤其是SHG。此外，先前用H&E染色处理的切片的去染色显著改善了它们在成像期间的SHG发射信号，从而允许对这些切片中的胶原进行充分的分析。

 

这些结果对于研究人员和病理学家从石蜡包埋组织和存档样本中获得额外信息以进行ECM的回顾性分析或从罕见样本中获得更多信息非常重要。

 

[1] Michael G. Monaghan, Sebastian Kroll, Sara Y. Brucker, and Katja Schenke-Layland. Enabling Multiphoton and Second Harmonic Generation Imaging in Paraffin-Embedded and Histologically Stained Sections. Tissue Engineering Part C: Methods.Jun 2016.517-523.

 

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