【摘要】 负染最好的结果是，它应该揭示出生物分子或其他颗粒的真实表面和形状。

人们普遍认为，Brenner和Horne(1959)发表了第一篇介绍生物颗粒负染色的工作技术的论文。对于那些没有意识到普遍情况的人来说，这可能有一点误导，因为电子显微镜工作完全是由鲍勃·霍恩完成的，正在研究的噬菌体样本是由西德尼·布伦纳生产的。鲍勃·霍恩和他的同事们随后继续在阴性染色的方法学方面做出了重大贡献，并将这项技术应用于许多不同的生物样本。尽管在其间的几年里，已经引入了无数种阴性染色的变体，但其基本原理是，一层薄薄的生物材料被包围，含有重金属的阳离子或阴离子盐的干燥无定形或冷冻水合/玻璃体层的渗透、支撑和嵌入保持不变。

 

Sacha[1]等人介绍了生物分子和病毒阴性染色的技术背景，然后扩展了不同的可能性和局限性。包括对吸附到碳支撑膜上的样品进行传统的风干负染，这种变种称为“负染碳膜”技术，以及对横跨多孔碳支撑膜孔的样品的负染，到考虑动态/随时间变化的负染。对于这些方法中的每一种，都给出了可获得数据的例子。还介绍了冷冻水化/玻璃化样品的低温负染制样技术。

 

负染最好的结果是，它应该揭示出生物分子或其他颗粒的真实表面和形状。从理论上讲，分子内的信息，如α-螺旋或β-折叠，不太可能通过负染色来揭示，这取决于生物材料和周围污渍之间相对较大的质量厚度差异，而不是蛋白质、碳水化合物和核酸分子与周围玻璃水/冰的不同质量厚度的更微妙的差异，这是未染色玻璃化标本的冷冻电子显微镜的情况。散焦诱导的位相对比对于未染色的生物标本很重要，也被认为有助于通过负染色进行电子成像。

 

图1四个通过吸附在连续碳膜上的生物分子样品的常规负染产生的电子显微镜图像的例子。[1]

 

经常被忽视的一点是，在阴性染色的标本风干后，相当数量的水仍然与生物材料结合在一起，并在看似无定形的周围污渍中。一旦插入电子显微镜的入口室，并受到高真空，这些结合水将被迅速去除。然而，如果将风干的负染标本在低温转移固定器中用液氮冷却，转移到电子显微镜并在低温条件下保持在电子显微镜内，结合水将不会被去除，就像整个低温负染过程中的情况一样。还应该记住，低温负染的玻璃化标本可以在电子显微镜下冷冻干燥，以便在去除玻璃体水后进行比较电子成像。

 

图2. 负染-碳膜技术制备2D蛋白质晶体的四个例子。[1]

 

他们已经深入讨论了可用于从大分子和病毒样本中生产风干负染样本的技术可能性的范围，并在图中展示了这些样本的一些可实现的电子图像。重点强调了生产风干样品所获得的好处，这些样品散布在孔中，并仅以负染色进行支撑。与云母扩散“负染-碳膜”程序一样，在负染和聚乙二醇中干燥的蛋白质和病毒样本已被证明在孔中形成二维晶体，在某些情况下还产生超分子组装。这种风干负片染色方法与低温负片染色特别相关，在低温负片染色中，样品最初也会散布在多孔碳支撑膜上，进行印迹，然后急速冷冻。

 

[1] S. De Carlo, J.R. Harris, Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM, Micron, 42 (2011) 117-131.

 

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