【摘要】 流式细胞术的基本原理与光散射和荧光发射有关，这是作为来自激发源（通常是激光束）的光照射运动粒子而发生的

历史上，最早开发的流式细胞术是一种仅检测细胞大小的单参数仪器。目前，高度复杂的仪器已经发展出能够同时检测14个参数的能力。流式细胞术能够测量单个细胞或任何其他颗粒的光学和荧光特性，例如当它们通过光源时，流体流中的微生物、细胞核和染色体制剂。

 

来源于抗体或染料的细胞的大小、粒度和荧光特征也是用于分析和分化细胞的参数的例子。流式细胞术的基本原理与光散射和荧光发射有关，这是作为来自激发源（通常是激光束）的光照射运动粒子而发生的（图1）。所获得的数据可以提供关于颗粒的生物化学、生物物理和分子方面的宝贵信息。

 

Macey等人[1]提出光散射与细胞的结构和形态特性直接相关，而来自荧光探针的荧光发射与结合到细胞或细胞成分的荧光探针的量成比例。

 

图1 流式细胞仪的基本工作原理

 

流式细胞术有两种不同的类型，称为非分选和分选。非分选型可以进行光散射和荧光发射，而分选型也具有分选颗粒的能力。荧光活化细胞分选机（FACS）是一种流式细胞仪，能够从混合细胞群中分选荧光标记的细胞。流式细胞仪和细胞分选机的主要组件基本上是流体学、光学（激发和收集）、电子网络（检测器）和计算机。

 

流体学负责将含有颗粒的液体引导到聚焦光源。激发光学器件将光源聚焦在细胞/颗粒上，而收集光学器件将颗粒的光散射或荧光传输到电子网络。电子网络检测信号并将信号转换为与光强成比例的数字数据，还需要计算机来分析数据。流式细胞术用于基于膜、细胞质和细胞核抗原检测的各种应用中。

 

此外，还可以通过流式细胞术研究全细胞和细胞成分，如细胞器、细胞核、DNA、RNA、染色体、细胞因子、激素和蛋白质含量。细胞增殖和细胞周期的分析、钙通量和膜电位的测量是流式细胞术开发方法的常用例子。

 

流式细胞仪有一个固定激发的光学工作台，该工作台包括固定位置的激光器、透镜和收集光学器件。透镜用于对激光束进行整形和聚焦。同时，激光通过用高压电将电子激发到高能轨道上来产生光。

 

Wilkerson等人[2]当这些带电的电子回落到它们的低能量轨道时，就会产生光子。激光照射细胞后，光在细胞边缘偏转，也称为光散射。出现两种类型的光散射，称为前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）（图2）。影响总光散射的因素包括膜、细胞核、细胞的粒度、细胞形状和表面形貌。

 

通常，单元或粒子的大小及其内部复杂性指定散射的类型。FSC光是沿着与激光束相同的轴收集的衍射的结果。FCS与细胞表面积或大小成比例，适用于检测大于给定大小的颗粒，这使其成为最常用的免疫表型方法。

 

另一方面，SSC光是对大部分折射和反射光的测量，这些光以与激光束成大约90度的角度收集。SSC与细胞粒度或内部复杂性成比例，这与源自荧光标记抗体或染料（如碘化丙啶（PI））的荧光以与SSC相同的角度反射一样重要。为了区分异质群体中的细胞类型，可以使用FCS和SSC的相关测量。

 

图2 光散射

 

[1] Macey MG. (2010). Principles of flow cytometry. Flow cytometry: principles and applications In: Macey MG, ed. Totowa (NJ): Humana Press, 1–15.

[2] Wilkerson MJ. (2012). Principles and applications of flow cytometry and cell sorting in companion animal medicine. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 42, 53–71.

 

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