流式细胞仪-流式细胞术

流式细胞仪装置

流式细胞仪由几个关键部件组成: (1)流式细胞; (2)测定系统; (3)检验器; (4)放大系统; (5)分析信号的计算机。它允许检测物理和生化特性的数千颗粒每秒。

首先，有一个“流动细胞”，它包含一个悬浮细胞(或其他颗粒)的液体流，这些悬浮细胞(或其他颗粒)排成一列，每次只有一个细胞通过。这涉及到“流体动力学聚焦”，其中悬浮的中央细胞流通过被向下移动的流体鞘包围的样品杯进食的过程。由于鞘液和样品液流动速度的不同，样品流被拉动并排列成这样一种方式，以便出现一个单个细胞流。

接下来，细胞顺序通过一系列激光前面，允许通过不同的探测器进行多参数测量。每个被测量的单元称为“事件”。与每个单个细胞相互作用的激光可以作为荧光灯散射、吸收和/或发射。

在单个细胞周围衍射的光被称为“前向散射”(FSC) ，在激光对面被检测到，其信号宽度指示细胞大小; “ FSC-Width 值”越高，细胞越大。从细胞侧面反射的光被称为“侧散射”(sSC) ，通过粒子侧面的检验器来测量，其强度提供了粒子组成/复杂度的读数。

它也可以是细胞中蛋白质含量的指标，并且已经显示与细胞大小相关。被细胞吸收的光可以发出荧光，特别是当细胞已经被一个或多个荧光探针标记，包括荧光标记的抗体。通过这种方法，可以测量细胞的一系列抗原、生物化学或生理标记或特性，并且可以在整个细胞群中检测和测量处于不同生理状态的不同细胞类型或细胞。

图1 流式细胞仪及细胞分选技术。在流动单元(1)中，将含有单元样品的流体注入鞘液流的中间。这两种流体具有足够的速度差，使它们不能混合。这允许细胞排列在一个单一的文件，这被称为流体动力聚焦。单个细胞文件通过激光器和探测器阵列(2) ，探测器阵列通过前向散射(FSC)测量细胞大小，通过侧向散射(SSC)测量细胞复杂度和荧光。在电池通过单个液滴(3)中的喷嘴退出流动电池之前，它们或者被提供电荷，或者不被提供电荷。具有电荷的所需单元的液滴被电磁铁(4)重新定向出下行流，进入侧面(5)的收集管。不带电的电池直接掉进废物收集箱。

数据采集、分析和荧光激活细胞分选

计算机可以绘制单个细胞通过激光束的事件。当细胞通过激光时，它会有效地在检验器上产生散射/发射光脉冲。这种光脉冲可以表示为信号的长度/宽度，高度或面积/积分(曲线下面的总面积)。宽度是细胞进入激光束和再次退出激光束之间的时间间隔。

高度是该电池的最大光散射/发射强度，而信号面积是该电池散射/发射的总光强，因为它描述了脉冲的积分。FSC 宽度是细胞大小的良好指示器，而 SSC 面积是细胞复杂性的良好指示器。最近，细胞自体荧光也被假定为细胞大小的良好指标。然而，人们总是应该测试每个菌株/细胞类型研究的细胞大小的最佳指标。

图2 用检验器测量光脉冲。当通过激光时，细胞散射或发射的光被检测为脉冲。细胞通过检验器所需的时间，即飞行时间(tOF) ，是信号的宽度，而脉冲的高度表示光脉冲的最大强度。信号的面积是脉冲的积分，表示电池散射/发射的总光。散射光和电池发出的光都可以表示为宽度(即长度)、高度或面积(即整数)。紫色阴影下的曲线，表示整数或面积。

因为不同荧光染料的发射光谱可能重叠，所以探测器上的信号必须经过电子补偿和计算来解析。我们可以制作直方图来显示细胞的分配，或者在轴上用散射或荧光强度值显示二维图(见图3)。荧光激活细胞分选(FACS)允许根据用户选择的细胞特性将独特的细胞亚群分选和收集到不同的容器中。

这涉及到一个被称为“门控”的过程，其中使用流式细胞术软件在感兴趣的细胞子集周围绘制一个窗口 (图3A)。例如，单个球形单元可以通过绘制 FSC 高度与 FSC 区域的最佳门控。沿对角线线性分布的事件是单个细胞，因为球形细胞的直径相似，与取向无关。

或者，FSC-Width 可以针对 FSC-Height 或 FSC-Area 绘制，并且任何双精度计将显示在主要的水平细胞亚群上方，因为双精度计的宽度是单细胞的两倍。

图3休眠分生孢子的散射特性。(a)一个典型的二维图，其中 Y 轴上的侧向散射(SCC)和 X 轴上的前向散射(FSC)显示休眠的烟麴霉野生型(CEA10)分生孢子。事件以彩虹伪彩色标度的形式显示，红色代表最高频率，蓝色代表最低频率。使用流式细胞仪软件的门控功能绘制的粗实线是主要为单一休眠分生孢子的门控，经流式细胞仪显微镜检查法验证。指示此门中事件的百分比。(b)直方图，仅显示(A)中休眠分生孢子门的事件。细胞计数显示了这些事件的 FSC 分配。

接下来，流通过一个充电环。当包含所需细胞的流的一部分通过时，它要么带正电荷，要么带负电荷，否则它保持中性。然后气流进入喷嘴，在那里它被分解成单个液滴通过压电元件产生的声波。所有液滴在两个电磁偏转板之间通过，一个带正电，一个带负电。然后将含有所需细胞的液滴(+/-)偏转并收集在中心流两侧的管中。中央溪流中多余的细胞直接进入废物收集站。

1.Robert-Jan Bleichrodt, Nick D. Read, Flow cytometry and FACS applied to filamentous fungi, Fungal Biology Reviews, Volume 33, Issue 1, 2019, Pages 1-15, ISSN 1749-4613, https://doi.org/10.1016/j.fbr.2018.06.001.

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