通过量子测量的原位流式细胞仪校准和单分子分辨率

流式细胞术是一种常用的光学技术，通过激光探测流过流室的细胞，以高通量的方式测量各种细胞特性¹。通过在样本中引入荧光标记物，流式细胞仪可以检测目标分子的存在，并揭示含有这些分子的细胞在异质群体中的分布。

在某些情况下，目标分子以微量形式存在于样品中。当流式细胞仪的探针体积中只有一种或几种荧光生物标志物时，激光功率的波动、光损耗、检测器噪声等因素使荧光信号难以检测。

虽然之前已经有人声称可以在流式细胞仪中检测到单个荧光分子，但这些说法并没有得到二阶相干的量子力学形式的严格证明，这种方法描述了通常使用Hanbury Brown和Twiss干涉仪测量的光源的强度相关性。

先前的声明依赖于样品浓度的先验知识和光子爆发的统计分析，这并不一定来自单一发射器，因为包括流池内气泡在内的大型散射体也可能产生这些爆发。

为此，Javier Sabines-Chesterking等人²提出了一种基于荧光生物标志物发射光的二阶自相关函数测量的单分子水平传感荧光生物标志物的理论模型。

该方法从第一性原理出发，提供了单分子灵敏度的原位验证。即使在存在背景噪声的情况下，它也可以明确地解决探针体积内发射器的数量。

这种方法的优点在于，它基于量子力学的规律，创建了一个独立的尺度来求解粒子的数量。该刻度不受损失的影响，因此，该测量使流式细胞仪的绝对校准方法成为可能，否则这是一项具有挑战性的任务。

从图1可以看出，即使在测量过程中发射体数量随机变化，仍然可以观察到g⁽²⁾(0)与平均发射体数量的关系。因此，基于相关性的流式细胞仪绝对校准是可能的。为了校准，需要准备一个生物标记物样品，这些生物标记物被充分稀释，但其确切浓度可能未知。

然后，应用一系列已知的稀释度来改变收集容积中发射器的平均数量，并进行一系列g⁽²⁾(0)测量。提出的实验设置如图2所示。用荧光生物标记物标记的稀释样品流过一个流动池，在那里用激光激发发射器进行询问。然后，收集荧光发射并进行光谱滤波以去除明亮激发光束产生的噪声。

图1 (a) g⁽²⁾对相关延迟时间t的典型依赖。b) g⁽²⁾(0) vs(平均)审问体积中的发射器数量。

图2 一种在流式细胞仪上对生物标志物发出的荧光信号进行自相关测量的实验装置。

使用该量表，量化了该研究的方法在样本群体中P极为罕见(P < 10⁻⁴)时识别生物标志物存在或不存在的能力。这种敏感性使该研究的方案适用于早期疾病的诊断或疾病复发的监测。

结果表明，对于可实现的信噪比(SNR)值，很少出现的单一生物标志物的鉴定可以以高成功率进行。证明该方法可以用来区分不同数量的生物标志物，也有很高的成功率。

1.Adan, A.;  Alizada, G.;  Kiraz, Y.;  Baran, Y.; Nalbant, A., Flow cytometry: basic principles and applications. Crit. Rev. Biotechnol. 2017, 37 (2), 163-176.

2.Sabines-Chesterking, J.;  Burenkov, I. A.; Polyakov, S. V. In Situ Flow Cytometer Calibration and Single-Molecule Resolution via Quantum Measurement Sensors [Online], 2022.

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