【摘要】 本文采用低温聚焦离子束扫描电子显微镜(cryo-FIB-SEM)对样品进行了研究。

通过扫描电子显微镜(SEM)观察细胞和组织的可视化结构对于理解生命科学研究的许多过程有很大的帮助。

 

细胞生物学、植物学和医学应用中的一个常见挑战是样品的水合特性，这与高端 SEM 成像所需的真空条件不相容。有两种通用的解决方案: (1)提取水，可选地被树脂代替; (2)冷冻固定水合样品并在 SEM 中保持冷冻状态。

 

请注意，低温固定也用于提取和/或替换水相的过程(例如冷冻干燥，冷冻替代) ，以最终获得可用室温电子显微镜研究的样品。本文采用低温聚焦离子束扫描电子显微镜(cryo-FIB-SEM)对样品进行了研究。

 

数十年来，冷冻样品在真空环境中的低温下断裂，以创建一个新鲜的表面来进行冷冻扫描电镜成像。低温压裂需要一些好运气才能在特定地物上进行压裂，而解释可能会受到表面粗糙度和裂缝碎片的阻碍。

 

在这个过程中引入 FIB 使得能够产生垂直于断裂表面的截面。FIB 截面没有与压裂有关的碎片和粗糙度。因此，在保持低温温度的情况下，FIB 研磨和随后的 SEM 成像揭示了样品的高度详细的结构信息。

 

仪器介绍

FIB-SEM 的是由一些制造商: 热费舍尔科学(前 FEI) ，Portland, Oregon，USA，日立，Jeol，Tescan和蔡司。用于大多数 FIB-SEM 的低温设备通常来自另一个制造商，必须根据 FIB-SEM 室布局的设计和特殊性能进行调整，以及满足研究目标。

 

目前的低温转移系统制造商在过去几年中减少了数量，Quorum (Quorum Technologies Ltd. ，Laughton，East Sussex，UK)和 Leica (Leica Microsystems，Vienna，Australia)仍然存在。

 

作者认识到，目前仍然存在着各种 FIB-SEM 与该领域过去和现在的制造商的低温转移系统的组合。我们要强调的是，所有原则都是通用的，应该可以转用于以前或更新的仪器模型，尽管一些细节可能针对具体的仪器特性。

 

本文提出的工作大部分来自 FEI Nova Nanolab 600双光束结合 Quorum PP2000T 低温转移系统(图1A)。

 

图1低温FIB-SEM设置：（A）安装在乌得勒支大学的FIB-SEM。中间是显微镜本身，右边是与冷冻转移系统相关的附加硬件。本文中显示的大多数结果都是用这种装置获得的。（B） 样品相对于FIB和SEM的位置示意图。使用常心位置时，两个光束在样品上的位置相同。在真中心位置工作是有益的，因为SEM可以检查正在进行的FIB铣削动作的进展。

 

FIB-SEM 仪器完全集成了两个柱，一个用于 FIB 研磨的液态金属离子源(镓离子)柱和一个用于成像的场发射枪(FEG)电子柱的高空间分辨率 SEM。所有低温 FIB-SEM 操作都发生在低压(10-5mbar-10-7mbar)下，以确保离子束和电子束的自由通道。

 

FIB 由一束加速的镓离子组成，镓离子聚焦在样品表面。镓离子向样品的动量转移导致样品原子的溅射，从而提供了产生截面的机制。入射离子与溅射原子之间的比值称为溅射产额，是球磨过程速度的度量。冰磨特别快。

 

因此，冷冻水合样品的横截面尺寸可以很容易地达到几百微米宽和几十微米深。SEM 提供了一个加速的、聚焦的电子束，扫描样品的表面。来自束流的初级电子在样品原子核的撞击下弹性散射。

 

结果，一些初级电子从表面下逃逸，变成后向散射电子(BSE)。疯牛病携带有关原子量，密度和晶体取向的目标体积的信息。从同一靶位产生非弹性散射的二次电子(SE)。SEs 是由它们的能量定义的，每个约定范围从 > 0eV 到50eV。

 

SE 只有在非常接近表面的情况下才能从样品中逃逸到真空中。因此，社企非常容易受到表面粗糙度的影响。其他产生的信号类型有 X 射线、阴极发光和俄歇电子，但是这些与目前的讨论无关。

 

商业上可用的低温转移系统包括许多组件。其中一些组件是常见的目的，而其他定义的方法，冷却方法和转让所使用的制造商。

 

在低温转移系统的核心是低温阶段和反污染。低温工作台通常安装在标准 FIB-SEM 工作台的顶部(去除短棒支架后)。防污染器通常安装在电子柱的极片周围，保护样品不受电子柱温暖表面的影响。

 

抗污染物有时被称为“冷阱”，它应该在比样品更低的温度下，以便“捕获”到达样品的污染物。阶段移动仍然可以通过正常的阶段移动操作提供的 FIB-SEM 制造商(图2A)。除了使用低温旋转阶段外，由于与低温阶段连接的电连接和管道或金属编织物，只有旋转受到限制。

 

低温阶段的顶部被主动冷却并容纳样品持有者。不同制造商之间的相似之处到此为止，因为所使用的冷却方法是不同的。

 

图2低温传输硬件: (A)带有冷氮气入口/出口管的低温阶段，以及用于温度读出和加热元件的电气连接。(B)具有冷冻压裂、升华、溅射涂层设施和能够冷却、真空转移到 FIB-SEM 室的 Quorum PP2000T 准备室。(C)转移杆用于冷冻单元(外部)、准备室和显微镜室之间的接口。(D)低温保持器/雪橇有多种类型，适用于不同的应用，可以包含一个或多个样品。定制这些部件很容易，可能是必要的，以适应实验。

 

1.HAYLES, M.F. and DE WINTER, D.A.M. (2021), An introduction to cryo-FIB-SEM cross-sectioning of frozen, hydrated Life Science samples. Journal of Microscopy, 281: 138-156. https://doi.org/10.1111/jmi.12951.

 

科学指南针在全国建立31个办事处和20个自营实验室，拥有价值超2.5亿元的高端仪器。检测项目达4000+项，覆盖材料测试、环境检测、生物服务、行业解决方案、模拟计算等九大业务。累计服务1800+个高校、科研院所及6000+家企业，获得了60万科研工作者的信赖。

 

免责声明：部分文章整合自网络，因内容庞杂无法联系到全部作者，如有侵权，请联系删除，我们会在第一时间予以答复，万分感谢。